<<
>>

Методы оценки иммунометаболических показателей

Исследование популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови проводили методом проточной цитометрии с использованием прямой иммунофлуоресценции цельной периферической крови. Клетки крови окрашивали двухцветными комбинациями моноклональных антител (BeckmanCoulter, USA), меченных FITC (изотио- цианатфлуоресцеин) и PE (фикоэритрин), к CD3/CD19, CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD16/56, CD3/HLA-DR и CD3/CD25. Для удаления эритроцитов пробоподготовку проводили по безотмывочной технологии с использованием лизирующего раствора OptiLyseC (BeckmanCoulter, USA).

Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре FC-500 (BeckmanCoulter, USA). Для корректного исключения из зоны анализа всех частиц, не соответствующих по размерам и гранулярности живым лимфоцитам, вводили необходимые логические ограничения в гистограммы распределения по малоугловому и боковому светорассеиванию. Дубль-негативную популяцию Т-лимфоцитов (CD3+CD4-CD8-) определяли как у5Т-лимфоциты [Шестакова Е.В. и др., 2008]. Определение количества HLA-DR-экспрессирующих моноцитов осуществляли определением HLA- DR+-клеток в моноцитарном гейте. Состояние клеточного звена иммунитета также характеризовали соотношением CD3+CD4+/CD3+CD8+.

Определение иммуноглобулинов проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини. Метод основан на реакции образования нерастворимого комплекса выявляемого иммуноглобулина со специфическими антителами к нему в тонком слое агара. Этот преципитат имеет форму визуально видимого кольца, диаметр которого пропорционален логарифму концентрации определяемого иммуноглобулина.

Состояние гуморального иммунитета характеризовали также уровнем относительного синтеза IgA (IgA/CD72+), IgM (IgМ/CD72+) и IgG (IgG/CD72+) [Земсков А.М., Земсков В.М., 1994].

Определение функциональной активности нейтрофильных гра- нулоцитов. Полученную суспензию нейтрофильных гранулоцитов дважды отмывали в растворе Хенкса без фенолового красного по 10 мин при 400 g. Супернатант сливали, оставшиеся нейтрофильные гранулоциты разводили в 1 мл раствора Хенкса и получали взвесь. Подсчитывали количество нейтрофильных гранулоцитов в камере Г оряева. Для проведения хемилюминесцентного анализа использовали следующие реактивы: донорскую сыворотку (группа крови АВ, резус-фактор отрицательный), раствор Хенкса (без фенолового красного), люцигенин или люминол в концентрации 50 мкг/мл и зимозан в концентрации 5 мкг/мл.

Готовили пробу для исследования спонтанной реакции: 200 мкл взвеси нейтрофильных гранулоцитов, 20 мкл донорской сыворотки, 240 мкл раствора Хенкса, 50 мкл люминола; для исследования индуцированной реакции: 200 мкл взвеси нейтрофильных гранулоцитов, 20 мкл донорской сыворотки, 200 мкл раствора Хенкса, 50 мкл люминола и 40 мкл оп- сонизированного зимозана. Хемилюминесцентный анализ проводили в двух кюветах: спонтанная хемилюминесценция осуществлялась без добавления индуктора, во вторую кювету добавляли опсонизированный зимозан или суспензию живых не опсонизированных бактерий. Измерение хемилюминесцентного ответа осуществляли при помощи хемилюминесцентного анализатора «CL3604» (производства СКТБ «Наука», г. Красноярск) в течение 90 мин. Регистрацию результатов и управление хемилюминесцентным анализатором осуществляли через компьютер. Получали кривые спонтанной и индуцированной хемилюминесценции. Индекс активации нейтрофилов (ИА-индекс) определяли по формуле:

ИА=Б

где: Shh^p^™ - величина площади под кривой хемилюминесценции, индуцированной опсонизированным зимозаном,

- величина площади под кривой спонтанной хемилюминесценции.

Биолюминесцентное определение активности НАД(Ф)- зависимых дегидрогеназ лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов: Определение активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах и нейтрофильных гранулоцитах проводили биолюминесцентным методом [Савченко А.А., Сунцова Л.Н., 1989]. Данным методом определялась активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), малик-фермента (НАДФМДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и НАДН-ЛДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции малатдегидроге- назы (МДГ и НАДН-МДГ), НАДФ- и НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ и НАДФН-ГДГ), НАД- и НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ и НАДН-ГДГ), НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ, соответственно) и глутатионредуктазы (ГР).

В 600 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносили 200 мкл суспензии разрушенных клеток лимфоцитов или нейтрофильных гранулоцитов.

Необходимо отметить, что в инкубационную смесь для определения активности НАДФИЦДГ и НАДИЦДГ дополнительно добавляли АДФ в концентрации 2,15 и 1,3 мМ соответственно. В среду инкубации для определения уровней НАДН-зависимых реакций НАДГДГ и НАДФН- зависимых реакций НАДФГДГ дополнительно вносили NH4CI в концентрации 5,0 мМ.

После инкубации при 37 °С в течение 30 мин (для ферментативных реакций с восстановлением НАД(Ф)) или 5 мин (для реакции с окислением НАД(Ф)Н) 200 мкл инкубационной смеси добавляли в кювету биолюми- нометра «БЛМ-8801» (производство СКТБ «Наука», г. Красноярск), куда предварительно вносили 50 мкл ФМН в концентрации 1,5* 10-5 М, 10 мкл в ферментативной системы НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза и 50 мкл 0,0005 % альдегида С14 (все реактивы биолюминесцентной системы разведены в 0,1 М К+, Ка+-фосфатном буфере с рН 7,0). Измеряли уровень биолюминесценции и при помощи калибровочной кривой определяли концентрацию НАД(Ф)Н в пробе. Ферментативная система НАД(Ф)Н: ФМНоксидоредуктаза-люцифераза изготовлена из очищенных методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации люциферазы из Photobacterium leiognathi и оксидоредуктазы из Vibrio fischeri в Институте биофизики СО РАН [Тюлькова Н.А., Антонова Э.В., 1991].

Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения тех или иных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определялись показатели, условно названные «фоны ферментов». Определение фонов ферментов проводили в тех же условиях, что и вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносили буфер.

Для построения графика зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАД(Ф)Н (калибровочный график) 200 мкл стандартного раствора НАД(Ф)Н в диапазоне 10-9-10-4 М вносили в кюветы биолюминометра, содержащие биолюминесцентные реактивы в концентрациях указанных выше, после чего проводилось измерение интенсивности биолюминесценции.

В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы из светящихся бактерий, калибровочные графики строились для каждого рН буфера.

Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ рассчитывали по формуле:

А=АСхух10-6/т,

где АС - разница концентраций НАД(Ф)Н2 в пробах «фермент» и «фон фермента»,

V - объем пробы, мл,

Т - время инкубации, мин.

Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах на 104 клеток, где 1 Е=1мкмоль/мин.

<< | >>
Источник: Савченко А.А.. Иммунометаболические нарушения при распространенном гнойном перитоните / А.А. Савченко, Д.Э. Здзитовецкий, А.Г. Борисов.- Новосибирск: Наука2013. 2013

Еще по теме Методы оценки иммунометаболических показателей:

  1. Оценка антропометрических показателей
  2. Основные демографические показатели и методы их расчета
  3. ГЛАВА 7 МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СИСТЕМЫ ЦИТОКИНОВ
  4. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СИСТЕМЫ ЦИТОКИНОВ
  5. Метод оценки хемотаксиса нейтрофилов с использованием камеры Бойдена
  6. Количественная оценка антителообразующих клеток (метод Йерне)
  7. Особенности постановки методов оценки хемотаксиса in vitro
  8. Савченко А.А.. Иммунометаболические нарушения при распространенном гнойном перитоните / А.А. Савченко, Д.Э. Здзитовецкий, А.Г. Борисов.- Новосибирск: Наука2013, 2013
  9. ФИ3ИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ
  10. Лабораторные показатели
  11. ПЛАНИРОВАНИИ, ОСНОВНЫХ ЭКОНОМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
  12. Показатели крови в различные возрастные периоды
  13. ЦВЕТНОЙ ПОКАЗАТЕЛЬ КРОВИ
  14. ПСА как показатель развития болезни
  15. Особенности состояния иммунологических показателей в зависимости от исхода распространенного гнойного перитонита
  16. Оценка киллинга фагоцитов
  17. Оценка и калькуляция
  18. 7.1. Оценка деятельности организации
  19. ОЦЕНКА ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ