МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ И ЯДЕРНЫХ БЕЛКОВ - ФАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ, СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ И ДРУГИХ

Методы твердофазных иммуноанализов типа ELISA используют и для изучения молекулярных процессов проведения сигналов от мембранных рецепторов внутрь клетки. Эксперименты такого типа состоят из двух этапов.

Творческий поисковый этап — создание модели активации определенных живых клеток in vivo или в культуре in vitro.

Технический этап:

а) лизис клеток без денатурации макромолекул;

б) детекция искомых молекул передачи сигналов методом лову- шечного ИФА.

В качестве «ловушки» на твердой фазе используют высокоспецифичные антитела к определенным эпитопам, характерным для активированного состояния молекул, например сайтам фосфорилирования конкретных белков, участвующих в проведении сигнала. В этой связи коммерческие тест-системы такого назначения получили название «phosphoELISA».

Внутриклеточные белки исследуют в целях анализа конкретных молекулярных путей проведения сигналов в клетке (англ, pathways — путь), определяя конкретные киназы, фосфатазы, адаптерные белки, факторы транскрипции и др.

Для исследования внутриклеточных цитоплазматических белков и их производных интересующие клетки тщательно отмывают от внеклеточных субстанций 2—3-кратным центрифугированием (800 g, 5—6 мин) в фосфатном солевом буферном растворе, после чего лизируют буфером следующего состава (одного из возможных): 50 шМ Tris, pH 7,4; 250 mM NaCl; 5 mM EDTA (этилендиаминте- траацетат); 1% NP40 (Nonidet Р40); 50 mM NaF; ImM Na3V04; 1 mM PMSF (ингибитор сериновых протеаз — трипсина и химотрипсина — фенилметан-сульфонил флюорид, матричный 0,3 М раствор в ДМСО, добавляют ex temporo); смесь ингибиторов протеаз (AEBSF, пепста- тин А, Е-64, бестатин, лейпептин, апротинин или других, добавляют ex temporo).

Осадок отмытых фосфатным буфером клеток ресуспендируют в лизирующем буфере и оставляют на 15 мин в условиях мягкого перемешивания. Затем лизат центрифугируют при 14 000 об/мин в течение 10 мин, разливают по аликвотам, определяют в нем общую концентрацию белков (чаще всего — методом Bradford). Наиболее приемлемы для дальнейших анализов концентрации белков 200— 400 мкг/мл.

В дальнейшем выполняют обычный ловушечный вариант ELISA (см. выше). Весьма важен как можно более многосторонний контроль (как минимум заведомо положительный контроль, заведомо отрицательный контроль, а также лизат одноименных, но неактивированных клеток, лизат клеток, обработанных «посторонним» биохимически родственным активатору веществом и др.).