Лабораторная работа 4-2 Твердофазный непрямой иммуноферментный анализ

1. На твердую фазу стандартных 96-луночных планшетов сорбируют заданные антигены. В большинстве тест-систем используют в качестве антигенов либо рекомбинантные белки, либо синтетические пептиды, реже — компоненты лизата натуральных вирусов.

Для приготовления 1 л буферного раствора берут 0,015 М (1,59 г) Na2C03 и 0,035 М, 94 г NaHC03 и растворяют в воде.

Раствор АГ вносят в лунки планшетов в объеме 50—100 мкл.

Существуют другие варианты посадочных буферов, например фосфатно-солевой буфер, pH 7,2 (PBS).

Для приготовления 1 л раствора PBS берут 0,0025 М дигидрофосфата натрия (0,345 г NaH2P04 х Н20, MW 137,99); 0,0075 М гидрофосфата натрия (2,68 г Na2HP04 х 12 Н20, MW 358,14) и 0,145 М хлористого натрия (8,474 г NaCl, MW 58,44).

Время, отводимое на сорбцию, подбирают опытным путем. Как правило, достаточно 12—16 ч при комнатной температуре или при +4 °С.

2. Лунки планшета тщательно промывают фосфатно-солевым буфером или водой с детергентом (0,1% Tween-20) 5—10 раз. В современных лабораториях процедуры отмывки осуществляют в аппаратах типа «вошер» (англ, to wash — мыть).

3. В некоторых случаях на следующем этапе в лунки вносят 1% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) или иного консервативного белка, например казеина, для так называемой «забивки» не покрытых антигеном площадей на дне лунок. Инкубируют 30—60 мин, после чего отмывают.

4. В лунки вносят исследуемые образцы биопроб в тех или иных разведениях. Для каждого разведения используют 2—3 лунки («параллели»). В качестве разводящей жидкости применяют PBS. В некоторых случаях в него добавляют 1% БСА. Инкубируют 1 ч и дольше. Время либо подбирают опытным путем, либо следуют инструкции к коммерческой тест-системе.

5. Отмывают (как описано выше).

6. Вносят конъюгат антииммуноглобулиновых антител с ферментом в заранее подобранном рабочем разведении или по инструкции к тест-системе. Инкубируют 1 ч.

7. Отмывают (как описано выше).

8. Вносят в лунки раствор субстрата того фермента, который входит в состав антииммуноглобулинового конъюгата. Если фермент — пероксидаза хрена, то субстратами могут быть ортофенилендиамин и перекись водорода. Эти субстраты растворяют в 0,1 М цитрат-фосфат- ном буфере, pH 5: цитрат х Н20 0,0347 М (7,3 г/л, MW 210,14); гидрофосфат натрия 0,0667 М (Na2HP04 х 12 Н20 23,87 г/л, MW 358,14).

На один планшет требуется 10 мл раствора. С небольшим запасом к 12 мл субстратного буфера добавляют 8 мг ортофенилендиамина и 5 мкл 30% перекиси водорода, быстро растворяют и раскапывают по лункам.

9. Через 15—30 мин в лунках, где произошла реакция «антиген- антитело», появится желто-коричневая окраска. Другие лунки останутся бесцветными. Для остановки ферментативной реакции в лунки вносят по 50 мкл 1 М раствора серной кислоты (55,5 мл 96 серной кислоты на 900 мл воды; строго добавлять кислоту в воду, а не наоборот!!!).

10. Интенсивность ферментативной реакции измеряют в единицах величины оптической плотности на спектрофотометрах, приспособленных для планшетов («мультисканах»). Для ортофенилендиамина длина волны проходящего света должна быть 492 нм (для тетраме- тилбензидина — 450нм). В связи с этим в мультискане устанавливают соответствующий светофильтр.

11. Современные спектрофотометры оснащены программным обеспечением, в котором предусмотрен автоматический расчет средних значений между параллелями и сравнение опытных показателей с показателями в контрольных лунках. Если такого обеспечения нет, то результаты анализируют «вручную».

Оптическую плотность (OD — optical density) в контрольных лунках принимают за некий «фон». Эти показатели умножают на 2; такую величину условно принимают за «линию раздела» — границу (cut off) между положительными и отрицательными значениями OD: значения ниже «cut off» считают отрицательными, значения выше «cut off» — положительными, значения, близкие к «cut off», — неопределенными, или «серой зоной».