<<
>>

Теломеры и теломераза

Теломеры, структуры на концах линейных хромосом эукариот, были впервые описаны в первой половине XX века Г ер- маном Мёллером в его классическом исследовании на дрозофиле (Muller, 1938).

Он отметил, что хромосомные инверсии, происхо­дящие при радиационно-индуцируемых двухцепочечных разры­вах, никогда не содержат самый конец хромосомы. Он же ввел тер­мин «теломера» от греческих слов «телос» (конец) и «мерос» (часть). Спустя некоторое время Барбара Мак-Клинток обнаружи­ла, что, в то время как нарушенные концы хромосом кукурузы сли­ваются, образуя дицентрики, ненарушенные концы не вызывают аберраций (McClintock, 1941). Таким образом, была доказана за­щитная роль теломер.

Почти сразу после открытия полуконсервативной природы ре­пликации ДНК было показано, что 3'-концы линейных хромосом не могут копироваться репликационной машиной из-за РНК-прай- мера, инициирующего синтез ДНК de novo и удаляемого при про­цессинге фрагментов Оказаки. Возникла идея, что с каждым кле­точным делением теряется короткий сегмент 5'-концевой дочерней цепи ДНК (Оловников, 1971; Olovnikov, 1973).

Данное укорочение не нарушает целостности генома до превышения критической ве­личины. Подобные же изменения в теломерах могут также быть вызваны экзонуклеазами, обрабатывающими 5'-конец родитель­ской цепи, и активными формами кислорода (Herbig, Sedivy, 2006).

В 1978 г. Элизабет Блекберн обнаружила, что теломеры рес­ничного простейшего Tetrahymena thermophila состоят из просто­го гексамерного повтора TTGGGG (Blackburn, Gall, 1978). Тело­меры клеток человека также состоят из тысяч повторов, но уже нуклеотидов TTAGGG. В 1986 г. было показано, что теломеры че­ловека не во всех тканях имеют одинаковую длину и что при деле­ниях нормальных фибробластов в культуре они укорачиваются (Shay, Wright, 2000).

Однако оставалась проблема теломер в половых и раковых клетках высших организмов.

В 1985 г. Кароль Грейдер открыла у Tetrahymena фермент теломеразу, синтезирующую повторы и удлиняющую теломеры (Greider, Blackburn, 1985). Позже этот фер­мент был обнаружен в экстрактах иммортальных клеточных ли­ний человека и в большинстве опухолей (Shay, Wright, 2000). На­конец, в 1998 г. внесение в геном фибробластов активной копии гена фермента теломеразы, достраивающего теломеры, доказало возможноть продления жизни клеточных популяций (Bodnar et al., 1998; Vaziri, Benchimol, 1998).

Теломеры — высокоспециализированные гетерохроматиновые ДНК-белковые структуры, защищающие концы хромосом эука­риотических клеток от деградации, рекомбинации или объеди­нения (Chai et al., 2005; Franco et al., 2005). Они необходимы для поддержания стабильности генома, точной репликации хромосом, опосредуют регуляцию клеточного цикла, перемещение и локали­зацию хромосом в ядре, транскрипционную регуляцию субтело­мерных генов, а также репликативное клеточное старение. У ря­да эукариотов теломеры имеют дополнительные специфические функции. Например, частая конверсия субтеломерных генов опре­деляет разнообразие поверхностных антигенов у трипаносом, бы­стро эволюционирующие семейства субтеломерных генов дают селективные преимущества линиям дрожжей (Riethman et al., 2004).

Структура теломер у большинства эукариотов высококонсер­вативна и представляет собой короткие прямые повторы, богатые G (на З'-конце) и C (в комплементарной цепи). Например, тело­мерная ДНК человека состоит из 5000—15 000 пар оснований по­вторяющихся гексамеров TTAGGG, следующих за одноцепочеч­ным выступом размером 100—400 нуклеотидов на З'-конце G-бо­гатой цепи (Kurz, 2004; Chai et al., 2005; Franco et al., 2005; LeBel, Wellinger, 2005; Herbig, Sedivy, 2006).

В норме теломерные концы не распознаются в качестве по­врежденной ДНК, что обусловлено различными защитными меха­низмами. Одноцепочечные З'-выступы теломер могут быть защи­щены белками, связывающимися с одноцепочечной ДНК, такими как Cdc13 у Saccharomyces cerevisiae, TEBP у ресничного простей - шего Oxytricha nova, или POT-1 у млекопитающих.

Одноцепо­чечный З'-выступ может быть также спрятан в специализирован­ном участке теломерной ДНК — в так называемой T-петле (Chai et al., 2005). T-петля формируется путем сворачивания З'-выступа в двухцепочечную ДНК (Franco et al., 2005). Структура Т-петли на­поминает промежуточный продукт гомологичной рекомбинации. Поэтому неудивительно, что белки гомологичной рекомбинации ДНК — Rad54 и Rad51D играют важную роль в кепировании (по­крове) теломер и регуляции их длины (Blasco, 2005).

Теломеры млекопитающих связаны со многими другими бел­ками, участвующими в защите от деградации и репарации двухце­почечных разрывов (Bitterman et al., 2003). Белок TRF1 формирует мультибелковый комплекс, участвующий в контроле длины тело­мер. Кроме того, этот комплекс включает TIN2, TANK1 и TANK2 поли(АДФ-рибозо)полимеразы, POT-1 и PTOP/PIP1, а также TRF2 через его взаимодействие с TIN2. Предполагают, что TRF2 играет фундаментальную роль в защите одноцепочечного теломерного выступа от деградации и в предотвращении объединения теломер. Он также привлекает к теломерам ряд других белков, участвую­щих в репарации ДНК, например комплекс MRE11, состоящий из RAD50, MRE11 и NBS1 и являющийся ключевым компонентом механизмов гомологичной рекомбинации и негомологичного со­единения концов, участвующих в репарации двухцепочечной ДНК. Кроме того, TRF2 взаимодействует с другими белками репарации ДНК: PARP-2, Ku, Werner, комплексом эксцизионной репарации нуклеотидов XPF/ERCC1. Последний выступает в роли экзону- клеазы, отсекающей З'-выступ при отсутствии функционального TRF2. В дополнение следует отметить, что TRF2 специфически связывает АТМ, что вызывает блокирование АТМ-зависимого от­вета на повреждение ДНК. Наконец, TRF2 привлекает к теломерам человека hRAP1, сверхэкспрессия которого вызывает удлинение теломер (Blasco, 2005).

Весь этот комплекс белков можно обнаружить на теломерах методом иммунофлуоресценции. Он получил название TIF (telo­mere dysfunction induced foci). В большинстве стареющих клеток часть теломер имеет признаки потери такой белковой защиты, о чем свидетельствует присутствие на них других белков, участвую­щих в репарации двухцепочечных разрывов, — y-H2AX, 53BP1, MRE11, ATM, Chk2 и Chk1 (Herbig, Sedivy, 2006).

Важная роль перечисленных белков в старении клеток не вы­зывает сомнений. Инактивация TRF2 приводит к клеточному ста­рению, зависимому от функции ключевых факторов распознава­ния поврежденной ДНК — ATM и р53. Главными компонентами сигналинга в ответ на укорочение теломер в фибробластах чело­века являются два субстрата фосфорилирования ATM — Chk2 и H2AX. Стареющие фибробласты в культуре накапливают y-H2AX, маркер двухцепочечных разрывов ДНК. Протеинкиназа Chk2 яв­ляется компонентом сигнального пути проверочной точки клеточ­ного цикла в ответ на повреждение ДНК, например, под действием ионизирующей радиации или при блокировании репликации гид- роксимочевиной. Активированный Chk2 в свою очередь фосфори- лирует супрессоры опухолей р53 и BRCA1 или представителей се­мейства CDC25-фосфатаз. В результате инициируются провероч­ные точки Gi, S или G2/M клеточного цикла, что обусловливает необратимую остановку роста стареющей клетки. В то же время ATM не только распознает сигнал о повреждении теломер, но и на­прямую участвует в поддержании их длины. Активация нижеле­жащего сигналинга в ответ на повреждение теломер присуща не только АТМ, но и его гомологу ATR, также способному фосфо- рилировать киназу Chk2 (Gire et al., 2004). В стареющих клетках количество связанного с теломерами ATM возрастает в 37 раз, а количество ATR — в 6 раз (Shay, Wright, 2004). При выключе­нии гена АТМ или его мишени Chk2 задержки в фазе G1 клеточ­ного цикла при клеточном старении не происходит. Однако по­врежденные теломеры все же активируют задержку в G2 через ATR/Chkl-сигнальный механизм (Herbig, Sedivy, 2006).

Универсальность данного механизма теломерозависимого ста­рения подтвердилась на модели дрожжей. В норме их теломеры не укорачиваются, так как клетки дрожжей имеют активный фермент теломеразу. Однако его выключение приводит к ускоренному реп­ликативному старению. Как оказалось, ферменты Tellp и Meclp (гомологи ATM и ATR человека) также участвуют в поддержании целостности теломер.

Meclp выступает в роли сенсора теломер­ных нарушений. Он связывается со структурно измененными те­ломерами, которые образуются в позднюю S-фазу или в резуль­тате дефектов метаболизма теломер (при делеции гена каталити­ческой субъединицы теломеразы est2 или гена репарационного белка yKu70). Tellp и Meclp взаимозависимо удерживаются на теломерах в течение всего клеточного цикла. В ответ на повреж­дение теломерной ДНК Meclp передает сигнал через Chkl и(или) Rad53/Dunl, активируя проверочную точку клеточного цикла и транскрипцию ферментов репарации. Киназа Tellp при поврежде­нии ДНК также подает сигнал на репарационный путь Rad53/Dunl (Shay, Wright, 2004). Таким образом, связанные с теломерами биохимические пути являются эволюционно консервативными. Эти пути продемонстрировали также роль Ku70 — фермента репа­рации двухцепочечных разрывов ДНК в поддержании теломер.

Исследования мышей с подавленной функцией репарацион­ного белка Ки86 и ДНК-зависимой протеинкиназы (БЫЛ-РК) по­казало, что эти белки также важны для защиты теломер. Отмена функции любого из них имеет результатом слияние хромосом. Кроме того, мутация в гене фермента БЫЛ-РК приводит к уско­ренному укорочению теломер с возрастом. Каков механизм их участия в поддержании теломер? БЫЛ-РК кооперируется с тело- меразой, участвуя в поддержании длины теломер, тогда как Ки86 является негативным регулятором теломеразы. Ки86 и БЫЛ-РК также принимают участие в распознавании и процессинге крити­чески укороченных теломер в качестве поврежденной ДНК (Езре- ]е1 е! а1., 2004; В1азсо, 2005).

Теломеры содержат нуклеосомы, что предполагает подвержен­ность модификациям их гистонов — ацетилированию, метилиро­ванию и фосфорилированию, изменяющим структуру хроматина. Как правило, конститутивный гетерохроматин является транскрип- ционно неактивным («молчащим») и характеризуется гипермети­лированием ДНК, гипоацетилированием гистонов, гиперметили­рованием гистонов Н3 и Н4. Теломеры представляют собой часть конститутивного гетерохроматина клетки.

Модельные объекты — дрожжи и мухи с дефектной активностью генов, модифицирую­щих состояние хроматина, характеризуются в частности, ненор­мальной регуляцией длины и функции теломер. Триметилирова- ние гистона Н3-К9 гистоновыми метилтрансферазами БиуЗЭИ яв­ляется маркером гетерохроматина, создавая участок связывания главного гетерохроматинового белка 1 (НР1). Мутация НР1 у дро­зофил приводит к дефекту покрова теломер и к увеличению часто­ты их рекомбинации. Все это свидетельствует в пользу эпигене­тического регулирования функции теломер. У мышей теломеры также обогащены триметилированным Н3-К9 и НР1. У данного объекта активность метилтрансфераз Биу39Ь1 и Биу39Ь2 необхо­дима для поддержания как триметилирования Н3-К9, так и связы­вания НР на теломерах. В результате мыши с двойной делецией 8т39Ъ1 и 8т39Ъ2 несут атипично удлиненные теломеры. Поте­ря гетерохроматинизации теломер не только играет роль в поддер­жании длины теломер, но и изменяет экспрессию близлежащих (прителомерных) генов — это так называемый «позиционный эф­фект теломер». Кроме того, эпигенетические модификации могут также регулировать связывание с теломерами белков ТИР1 и ТКР2, защищающих их от распознавания в качестве поврежденной ДНК. Действительно, у мутантов 8т39Ъ наблюдали увеличение связы­вания ТИР1 на единицу ТГЛССС-повторов (В1аБСО, 2005).

Укорочение теломер с возрастом, являющееся следствием не­способности отстающей цепи закончить репликацию концов ли- 93

нейных хромосом — это так называемая проблема концевой недо- репликации, предсказанная А. М. Оловниковым (1971). На модели дрожжей было показано, что концевая недорепликация приводит к потере 4—6 оснований за клеточное деление. В культуре фиб­робластов человека скорость укорочения составляет 48 ±21 пар оснований за удвоение клеточной популяции. Исследования in vivo на лимфоцитах выявили укорочение на 33 пары оснований в год (Xu, Yang, 2003).

В культуре неопухолевых клеток человека клетки вступают в репликативное старение (фазу смертности 1, M1), когда по край­ней мере несколько теломер достигают критического укорочения (Shay, Wright, 2005). Иногда в таких клетках наблюдается слияние теломер (Herbig, Sedivy, 2006). Репликативное старение в культуре может быть преодолено инактивацией белков р53 и ретинобласто- мы (Rb), что приводит к некоторому увеличению продолжитель­ности жизни клеток перед достижением фазы кризиса (M2), когда большинство клеток подвергается апоптозу из-за большого коли­чества накопленных повреждений ДНК (Chai et al., 2005; Shay, Wright, 2005). Изредка в клетках на стадии М2 теломераза реакти­вируется, что приводит к неконтролируемой пролиферации. Та­кая иммортализация является лимитирующим шагом в канцероге­незе (Shay, Wright, 2005). Существует и обратная взаимосвязь между длиной теломер, функциями регуляторов клеточного цикла и старением — отсутствие членов Rb-семействаp107 и p130 вызы­вает удлинение теломер (Blasco, 2005). Таким образом, очевидно, что репликативное старение регулируется длиной теломер. Одна­ко как это осуществляется? Дисфункция теломер может быть ре­зультатом изменений, стимулирующих постепенную или быструю потерю последовательностей теломер, или уже упоминавшихся изменений в теломера-ассоциированных белках, покрывающих теломеры (Bailey, Murnane, 2006).

Первая гипотеза возникла на основе наблюдения, согласно ко­торому G-богатый 3'-выступ теломер разрушается при старении. Было высказано предположение о том, что потеря этой последова­тельности является молекулярным сигналом, запускающим старе­ние. Однако не ясно, является ли потеря выступа первичным собы­тием, или же это вторичное следствие укорочения теломер, даю­щее сигнал о повреждении ДНК. Этот сигнал может индуцировать события процессинга теломерного конца, приводящие к укороче­нию выступа (Chai et al., 2005).

Согласно второй гипотезе, индукция происходит вследствие инициированного слишком короткими теломерами нарушения бел­кового покрова теломерных концов. Действительно, эктопическая экспрессия доминантно-негативной формы белка TRF2, связы­вающегося с теломерой, индуцирует быструю потерю З'-высту- па, объединение концов хромосом, остановку клеточного роста даже без потери двухцепочечной теломерной ДНК. Обнаружено, что исчезновение выступа в клетках с нефункциональным TRF2 является следствием разрезания выступа по D-петле эндонуклеа­зой ERCC1/XPF, а не разрушения самого одноцепочечного вы­ступа. Кроме того, нормальные фибробласты человека способны сохранять одноцепочечные теломерные выступы при старении (Chai et al., 2005). Следовательно, не потеря одноцепочечного вы­ступа, а утрата покрывающих белков (например, TRF2) может вести к клеточному старению. Каким образом это происходит? Укорочение теломер индуцирует сигнал о двухцепочечном раз­рыве ДНК, который стимулирует р53-зависимую необратимую за­держку клеточного цикла или апоптоз (Gire et al., 2004; Franco et al., 2005).

Наконец, третим возможным механизмом репликативного ста­рения является потеря с возрастом сайленсинга (подавления ак­тивности) прителомерных генов. Уже упоминавшийся «позицион­ный эффект теломер», или теломерный сайленсинг, наиболее дета­льно изучен у дрожжей. У Saccharomyces cerevisiae белок Raplp взаимодействует с теломерными повторами и вместе с белками ре­парации и рекомбинации yKu70p и yKu80p, связывающимися с хромосомными концевыми участками, привлекает белковый ком­плекс сайленсинга (Mason et al., 2004). У дрожжей теломеры слу­жат хранилищем факторов сайленсинга (Sir2/3/4), которые изме­няют конформацию хроматина и активность генов, в зависимости от расстояния данных генов от теломеры и от длины самой теломе­ры. Кроме того, вероятно, что эти белки способствуют минимиза­ции возможности рекомбинации между теломерными повторами. Интересно отметить, что укорочение теломер и старение клеток дрожжей (в отличие от клеток млекопитающих) увеличивает ре­пликативную длительность жизни, так как ведет к перераспре­делению деацетилазы Sir2 (см. разд. 3.3) с теломер в ядрышко, содержащее 140тандемных копий рибосомальной ДНК на хро­мосоме XII, что повышает общую стабильность ДНК (Guarente, Ruvkun, 1998; Bitterman et al., 2003; Pedram et al., 2006).

Изменение транскрипции генов в стареющей клетке млекопи­тающих также может отчасти быть вызвано перераспределением факторов подавления экспрессии с укорачивающихся теломер в другие области (Bitterman et al., 2003). Действительно, позицион­ный эффект теломер в клетках млекопитающих прямо пропорцио­нален длине теломер (Baur et al., 2001). Трансгенные копии мар­керных генов, внедренных в прителомерные области, экспресси­руются на очень низком уровне по сравнению с такими же генами, но встроенными в другие участки. Причем спустя некоторое время происходит полное подавление экспрессии за счет метилирования ДНК (Pedram et al., 2006). Транскрипция субтеломерных генов мо­жет регулироваться длиной TTAGGG-последовательности, содер­жимым и численностью субтеломерных участков, а также благо­даря наличию специфических последовательностей, необходимых для локального сайленсинга, или путем предоставления длинных гомологичных участков, на которых происходит формирование гетерохроматина (Riethman et al., 2004). Потеря эффекта положе­ния в результате укорочения теломер представляется одной из ве­роятных причин постепенного изменения профиля генной эксп­рессии при увеличении репликативного возраста клетки. Теломер­ный эффект положения может также играть роль в наследственных заболеваниях человека в результате перемещения активных генов к теломерам или к субтеломерным последовательностям при хро­мосомных перестройках, например у индивидуумов с кольцевыми хромосомами (Pedram et al., 2006).

Субтеломерные структуры млекопитающих состоят из субте­ломерных повторов, сегментных дупликаций, сателлитных после­довательностей и внутренних TTAGGG-подобных последователь­ностей. Кроме того, для каждой субтеломерной структуры чело­века описаны транскрипты, в общей сложности их 941, из них 15 % — это возможные псевдогены (нефункционирующие гены). Субтеломерные гены по нуклеотидной последовательности имеют сходство с генами тяжелых цепей иммуноглобулинов, обонятель­ных рецепторов, генов белков типа «цинковых пальцев», F-box- белков (Riethman et al., 2004). Была проанализирована экспрессия 34 субтеломерных генов в молодых и старых фибробластах чело­века. Показано, что сама по себе длина теломер не определяет уро­вень экспрессии таких генов. Однако эпигенетическое изменение локальной структуры теломерного гетерохроматина может оказы­вать влияние на экспрессию. Выявлено, что повышенная экспрес­сия прителомерных генов MGC3101 и CPNE7 запускалась клеточ­ным старением, тогда как экспрессия GAS11 (гена фактора задерж­ки роста клетки) и CDK10 (гена киназы, родственной CDC2 и регулирующей С2/М-фазу клеточного цикла) увеличивается как в стареющих, так и в покоящихся клетках, т. е. она индуцируется задержкой клеточного цикла (Ning et al., 2003). В другом экспери­менте, изменения активности известных субтеломерных генов (ге­нов обонятельного рецептора, рецептора IL9 и RABL2B) при старе­нии не отмечалось. Не было выявлено диспропорции между возра- стзависимой сверхактивацией субтеломерных генов и генов из других участков хромосом (Zhang H. et al., 2003). Таким образом, роль потери сайленсинга прителомерными генами при глобальном изменении паттерна экспрессии в стареющей клетке остается под вопросом.

Однако есть еще один путь участия процесса укорочения тело­мер в клеточном старении. Утрата функции теломер является важ­нейшим механизмом хромосомной нестабильности. Она приводит к соединению сестринских хроматид и активации цикла фраг- мент/соединение/мост, приводящего к масштабной амплифика­ции ДНК или большим концевым делециям. Путем транслокаций данная нестабильность мигрирует с одной хромосомы на другую (Bailey, Murnane, 2006). Помимо репликативного старения это мо­жет благоприятствовать опухолевому перерождению клетки.

Оксидативный стресс также может индуцировать или уско­рять репликативное старение (так называемое стресс-индуцируе- мое преждевременное старение) по механизму образования одно­цепочечных разрывов в теломерной ДНК (Kurz, 2004).

Следует иметь в виду, что за остановку репликации ответст­венны не одна-две короткие теломеры, а целый набор из несколь­ких таких теломер (около 10 % общего их количества) (Zou et al., 2004). Наиболее короткие теломеры обнаруживаются при старе­нии в местах скопления белков-маркеров двухцепочечных разры­вов — Y-H2AX/53BP1 (Chai et al., 2005), что позволяет видеть ста­реющие клетки под микроскопом.

Индивидуальная длина теломер различных хромосом в одной и той же клетке очень гетерогенна (Zou et al., 2004). Как и предпо­лагал А. М. Оловников (1971), после репликации родительская и дочерняя цепи ДНК имеют разную длину. Причины этого явле­ния — не только недорепликация конца отстающей цепи ДНК, но и пострепликативный процессинг теломеры. В зависимости от того, какая цепь используется в качестве матрицы, дочерние клет­ки наследуют теломеры разной длины, что приводит к варьирова­нию размеров в пределах нескольких килобаз после 50 удвоений популяции клеток в культуре, причем даже для потомков одной те­ломеры определенной длины. Дополнительный фактор, вносящий вклад в вариабельность размеров, — оксидативное повреждение, стохастически действующее на теломеры и ускоряющее их укоро­чение (Zou et al., 2004).

Таким образом, средняя длина теломер варьирует между клет­ками одной и той же ткани, отражая различия в репликативной ис­тории (степень клональной экспансии). В большей мере это каса­ется разных индивидуумов одного возраста. В то же время иссле­дования лейкоцитов периферической крови у близнецов выявили, что на 78 % индивидуальная гетерогенность наследственно детер­минирована. Мужской пол, курение и высокое кровяное давление коррелируют с более короткими теломерами наравне с ранним возникновением инфаркта миокарда, каротидного атеросклероза и коронарных болезней (Kurz, 2004). Несмотря на то что длина тело­мер флуктуирует, существует определенная минимальная (крити­ческая) длина, необходимая для их нормального функционирова­ния (LeBel, Wellinger, 2005).

Половые и стволовые клетки избегают проблемы критическо­го укорочения теломер благодаря наличию активного фермента теломеразы. Этот фермент добавляет TTAGGG-повторы к кон­цам хромосом. Он состоит из двух компонентов, кодируемых раз­ными генами — геном обратной транскриптазы (telomerase reverse transcriptase — Tert) и геном РНК-компонента (telomerase RNA component — Terc), являющегося матрицей для синтеза новых те­ломерных повторов (Blasco, 2005). Теломераза использует 3'-ко- нец G-хвоста (одноцепочечного теломерного выступа) в качестве праймера для добавления G-повторов в соответствии со своей РНК-матрицей. С-богатая цепочка теломеры достраивается ре­пликативным аппаратом клетки по принципу комплементарности. Синтез теломерных повторов происходит в поздней S-фазе кле­точного цикла (LeBel, Wellinger, 2005).

В то же время большинство нормальных соматических клеток человека имеет предельно низкий уровень теломеразной актив­ности и подвергается изнашиванию теломер с каждым клеточным делением (Blasco, 2005). После рождения существенная актив­ность теломеразы отмечается лишь в герминативных клетках, в некоторых соматических стволовых клетках (таких как гематопоэ­тический росток и стволовые клетки эпидермиса), в клетках-пред- шественницах и в пролиферирующих лимфоцитах (Kurz, 2004; Sharpless, DePinho, 2007). Лимитирующим компонентом теломе­разной активности является обратная транскриптаза hTERT, тог­да как hTERC присутствует и в теломераза-негативных клетках. Дело в том, что транскрипция hTERT в нормальных клетках че­ловека подавлена репрессором, расположенным на 3-й хромосо­ме и расщепляющим мРНК hTERT во втором интроне (Szutorisz et al., 2003). Теломеразная активность в соматических клетках ре­гулируется несколькими путями: транскрипционной регуляцией каталитической субъединицы hTERT, посттранскрипционным ее фосфорилированием протеинкиназой Akt, активным транспортом hTERT к теломерам и от них (Kurz, 2004).

Как и следовало ожидать, реактивация теломеразы предотвра­щает критическое укорочение теломер и увеличивает выживае­мость как клеток в культуре, так и клеток теломераза-дефицитных мышей in vivo (Bodnar et al., 1998; Vaziri, Benchimol, 1998; Blas­co, 2005). Сверхактивация каталитической субъединицы челове­ческой теломеразы (hTERT) может приводить к иммортализации некоторых типов соматических клеток: фибробластов на стадии предстарения, пигментированных эпителиальных клеток ретины, клеток сосудистого эндотелия, мезотелиальных клеток. Однако ее реактивация не является достаточным фактором для иммортализа- ции других клеток — фибробластов молочной железы, эпители­альных клеток человека, миобластов и меланоцитов, кератиноци- тов, уротелиальных клеток мочевого пузыря, клеток эпителия про­статы (Rheinwald et al., 2002; Hardy et al., 2005).

Теломераза предотвращает критическое укорочение теломер более чем в 90 % злокачественных опухолей человека. Некоторые клеточные линии и опухоли, потерявшие теломеразную актив­ность, все еще способны поддерживать или удлинять теломеры благодаря альтернативным механизмам, основанным на рекомби­нации. Клетки, индуцировавшие альтернативное удлинение тело­мер (ALT), характеризуются одновременным присутствием ко­ротких и длинных теломер в одном и том же ядре, а также нали­чием ALT-ассоциированных PML-телец. Каков механизм ALT? По крайней мере у дрожжей ALT опосредовано гомологичной ре­парацией и репарацией ошибочно спаренных оснований. У млеко­питающих ключевую роль в ALT играет фермент гомологичной репарации Rad54. Делеция его гена приводит к существенной по­тере теломерной последовательности и высокой частоте соедине­ния концов хромосом. Фактор генетической рекомбинации Rad51D также необходим для поддержания длины теломер и их покрова. Наконец, активность уже известных нам (см. выше) факторов гете- рохроматинизации играет важную роль в механизме ALT (Kurz, 2004; Blasco, 2005).

Насколько консервативно функционирование теломер у эука­риотов? Дрожжевые клетки дикого типа постоянно экспрессируют теломеразу, и их теломеры не укорачиваются при репликации. Тем не менее делеция генов теломеразы дрожжей (est2 или tlcl, кодирующих каталитическую субъединицу и РНК-матрицу соот­ветственно) приводит к укорочению теломер и репликативному старению: популяция клеток перестает делиться, когда теломеры достигают критической величины, что распознается клеткой как двухцепочечный разрыв ДНК (Bitterman et al., 2003). Наступает перманентная С2/М-задержка клеточного цикла. Изредка такие мутантные клетки избегают старения, используя RAD52-зависи- мый рекомбинационный механизм поддержания теломер (Azam et al., 2006).

В результате налицо гомология ключевых аспектов биохимии теломер от дрожжей до млекопитающих. Как оказалось, Saccharo­myces cerevisiae обладают геном супрессора роста Sgslp, гомоло­гом гена синдрома преждевременного старения Вернера (WRN).

Мутация Sgslp в клетках с выключенной теломеразой вызывает ускоренное старение, напоминающее фенотип клеток синдрома Вернера. При этом нарушается процесс восстановления теломер­ной ДНК, основанный на рекомбинации (Bitterman et al., 2003). Ка­ким образом RecQ 3'-5'-ДНК-геликазы, к которым относятся Sgslp дрожжей, а также белки синдромов Вернера (WRN), Блума (BLM) и Ротмунда—Томсона (RTS) у человека, принимают участие в биологии теломер? Sgslp вовлечен в изс^-зависимый рекомбина­ционный механизм поддержания теломер. Экспрессия Sgslp за­медляет старение у мутантов по теломеразе дрожжей tlcl. В дан­ном эффекте ключевая роль принадлежит доменам Sgslp, ответст­венным за гомологическую рекомбинацию (геликазный домен и участок взаимодействия с топоизомеразой III). Для сравнения хо­телось бы отметить, что общая геномная нестабильность, вызван­ная мутациями генов дрожжей mus81, srs2, rrm3, slxl и topl, не ускоряет старения мутантов tlcl. Аналогично WRN и BLM мле­копитающих взаимодействуют с белком теломерного хроматина TRF2, участвующим в формировании защитных Т-петель. Сверх­экспрессия гена BLM удлиняет теломеры путем рекомбинации, а одновременное наличие у мышей мутаций гена теломеразы ( Terc) и генов Wrn или Blm ускоряет дисфункцию теломер (Azam et al., 2006). Напротив, выключение только гена Wrn не приводит к выраженной дисфункции, благодаря тому что у мышей длинные теломеры и относительно высокая теломеразная активность (Du et al., 2004). Таким образом, аналогия между репликативным ста­реним дрожжей и частичной прогерией Вернера у человека может свидетельствовать об общности механизмов, основанных на гели- казазависимом поддержании функции теломер или, по крайней мере, на нестабильности генома в целом.

Скорее исключением, чем правилом являются хромосомные концы у дрозофил. Они устроены иначе, чем у дрожжей, простей - ших, нематод и млекопитающих. Для удлинения хромосом дрозо­фила использует три вида ретротранспозонов (мобильных генети­ческих элементов) с недлинными концевыми повторами: HeT-A, TART и TAHRE. Длина и состав массивов из этих ретротранспозо­нов может значительно варьировать как между разными теломера­ми, так и между линиями мух. Рядом с набором концевых ретро­транспозонов на теломерах дрозофил находится несколько килобаз сложных сателлитов, носящих название «теломера-ассоциирован- ные последовательности» (TAS), которые структурно подобны ана­логичным последовательностям других эукариотов. Несмотря на то что дрозофила не обладает набором простых повторов, связы­вающих такие белки, как Raplp, она имеет общие с другими орга­низмами свойства теломерных последовательностей, в частности

теломерный эффект положения. В данном явлении, по-видимому, ключевую роль играют TAS (Mason et al., 2004; Walter et al., 2006).

Кратко подытожим данные, свидетельствующие в пользу роли укорочения теломер в обеспечении лимита Хейфлика — реплика­тивного старения клеток (Weinstein, Ciszek, 2002).

1. Длина теломер уменьшается с возрастом клеточной линии in vitro.

2. Большинство иммортальных линий клеток теряет лимит Хейфлика, при этом они реактивируют фермент теломеразу, до­страивающую теломеры.

3. Соматические ткани пациентов с синдромами преждевре­менного старения имеют пониженную репликативную способность in vitro. Больные синдромом Хатчинсона—Джилфорда имеют бо­лее короткие теломеры уже при рождении, у больных синдромом Вернера происходит быстрая эрозия изначально нормальных те­ломер, причем данная эрозия может быть предотвращена in vitro активацией теломеразы.

Тем не менее лишь у человека удалось идентифицировать по­врежденные теломеры в стареющих (накапливающих старение-ас - социированную ß-галактозидазу) клетках in vivo (Martin, Buckwal­ter, 2001; Chai et al., 2005). По-видимому, это связано с тем, что те­ломеры человека гораздо короче, чем, например, у мышей, и в большинстве соматических клеток людей активность теломеразы репрессирована. У многих модельных объектов (дрожжей, мы­шей) теломера-ассоциированное репликативное старение удается обнаружить лишь в случае вмешательств, приводящих к выклю­чению механизмов, достраивающих теломеры. Этот факт, а так­же ряд других спорных моментов теломерной гипотезы старе­ния вынудили А. М. Оловникова отказаться от ее дальнейшего использования. В настоящий момент он развивает новую «реду- мерную» концепцию. Где помещаются в клетке эти предполагае­мые структуры? Редумеры в комплексе с белками образуют части­цы «редусомы», расположенные вдоль соответствующих хромо­сом. Оловников постулировал, что за процесс старения может отвечать идущее одновременно с укорочением теломер убывание длины редумер, что потенциально способно генерировать сигнал старения благодаря снижению числа генов, теряемых на конце ре­думеры. Таким образом, согласно Оловникову, именно редусомы, а не теломеры являются «молекулярными часами» процесса старе­ния (Оловников, 2005).

Подводя итоги, следует отметить, что, согласно имеющимся экспериментальным данным, концевые участки линейных хромо­сом эукариотов (теломеры) при отсутствии фермента теломеразы и рекомбинантных механизмов восстановления их длины укора- 101

чиваются с каждой репликацией ДНК. В результате концы хромо­сом теряют защитные структуры (связанные с ними покровные белки и Т-петлю) и воспринимаются клеткой в качестве нерепа- рируемых двухцепочечных разрывов, что является сигналом для индукции апоптоза или перманентной остановки деления (репли­кативного старения), либо служит причиной возникновения не­стабильности генома и бласттрансформации. Еще одним возмож­ным механизмом участия возрастзависимого укорочения теломер в старении клетки является разблокирование активности молча­щих прителомерных генов. По-видимому, генные сети, которые индуцируются в клетках в ответ на повреждение ДНК, связывают укорочение теломер с лимитом Хейфлика, а также старение на клеточном и на организменном уровнях. Как оказалось, эффектор- ные механизмы репликативного старения схожи с механизмами так называемого стресс-индуцируемого преждевременного ста­рения клетки, вызываемого оксидативным или генотоксическим стрессами. Рассмотрим эти механизмы.

<< | >>
Источник: Москалев А. А.. Старение и гены. — СПб.: Наука,2008. — 358 с.. 2008

Еще по теме Теломеры и теломераза:

  1. Коллектив авторов. Медицинская помощь на судах, 2002. — 111 с., 2002
  2. ГЛАВА 1 ОРГАНИЗАЦИЯ ПЕРВОЙ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ НА СУДАХ
  3. ГЛАВА 2 ОСНОВЫ АНАТОМИИ И ФИЗИОЛОГИИ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА
  4. 2.1. ОПОРНО-ДВИГАТЕЛЬНЫЙ АППАРАТ
  5. 2.2. СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТАЯ СИСТЕМА
  6. 2.3. СИСТЕМА ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ
  7. 2.4. ПИЩЕВАРИТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА
  8. 2.5.  СИСТЕМА МОЧЕВЫДЕЛЕНИЯ
  9. 2.6.  СИСТЕМА ПОЛОВЫХ ОРГАНОВ
  10. 2.7.  НЕРВНАЯ СИСТЕМА
  11. 2.8.  ОРГАНЫ ЧУВСТВ
  12. 2.9.  КОЖА
  13. ГЛАВА 3 ПЕРВАЯ ПОМОЩЬ ПРИ НЕСЧАСТНЫХ СЛУЧАЯХ
  14. 3.1.  ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОКАЗАНИЯ ПЕРВОЙ ПОМОЩИ
  15. 3.2.  АСЕПТИКА И АНТИСЕПТИКА
  16. 3.3 РАНЫ
  17. 3.4. ЛЕЧЕНИЕ РАН
  18. 3.5. ПРАВИЛА НАЛОЖЕНИЯ ПОВЯЗОК
  19. 3.6. ОСНОВНЫЕ ВИДЫ ПОВЯЗОК
  20. 3.7. КРОВОТЕЧЕНИЯ