Система детоксификации, протеолиза и автофагии

Основная задача детоксификации — метаболизация ксенобиотиков, приводящая к снижению их активности. В общей сложности в данном процессе участвует около 30 различных ге­нов. Различают две фазы детоксификации: фаза I — модификация, создающая или высвобождающая функциональные группы; фаза II — конъюгация, т.

У долгоживущих генетических моделей происходит актива­ция процессов детоксификации. С использованием анализа олиго­нуклеотидных чипов у нематод были идентифицированы классы генов, чья экспрессия изменяется сходным образом у личинки dauer и у долгоживущих мутантов daf-2. Сверхэкспрессии под­верглись гены цитохрома P450, короткой цепи дегидрогеназы/ре­дуктазы, УДФ-глюкуронозилтрансферазы, глутатион^-трансфе- разы. Эти гены играют важную роль и в регуляции метаболизма, и в экскреции токсичных эндобиотиков и ксенобиотиков. Гем­содержащие тиоловые белки P450 метаболизируют эндобиоти­ческие липофильные субстраты, такие как стероиды, жирные ки­слоты, простагландины и липофильные ксенобиотики. Функция короткоцепочечных дегидрогеназ/редуктаз заключается в деток­сификации ксенобиотиков — в восстановлении карбониловых групп альдегидов и кетонов за счет энергии NADH. УДФ-глюку- ронозилтрансферазы, действующие в гладкой ЭПС, подвергают глюкуронидированию (у насекомых — гликозилированию) ма­лые липофильные молекулы, делая их водорастворимыми, что обеспечивает их экскрецию. Субстратами этих ферментов могут быть стероиды и жирные кислоты, ксенобиотики и нежелатель­ные эндобиотики. У имаго daf-2 наблюдается сверхактивация глю- татион^-трансфераз, функционирующих в цитозоле и катализи­рующих добавление трипептида глутатиона к эндогенным и ксе- нобиотичным электрофильным субстратам, которые после этого становятся более растворимыми. Кроме того, этот фермент участ­вует в детоксификации благодаря своей пероксидазной актив­ности или способности к пассивному связыванию с токсином (McElwee et al., 2004).

Помимо собственно обезвреживания ксенобиотиков рассмат- рим роль в старении протеосомальной системы и автофагии. В ста­реющей клетке имеет место оксидативный стресс (см. разд. 4.1.2). В результате количество оксидативно поврежденных макромоле­кул увеличивается с возрастом практически у всех исследованных видов и вносит свой вклад в старение (Honda, Honda, 1999; Taver- narakis, Driscoll, 2002; Bayne et al., 2005).

Среди модификаций белков, накапливающихся при старении, наиболее изучено карбонилирование, происходящее при окисле­нии боковых цепей аминокислот и затрагивающее до 30 % белка (Tavernarakis, Driscoll, 2002; Martin, Grotewiel, 2006). Глиоксаль и метилглиоксаль, побочные продукты метаболизма, обусловли­вают еще один вид повреждений — гликозилирование белков, так­же играющее важную роль в старении. Белки могут претерпевать и другие модификации: рацемизацию, изомеризацию и дезаминиро­вание, оказывающие умеренное разрушительное воздействие на функцию белков (Tavernarakis, Driscoll, 2002).

Липиды — ключевые компоненты мембран — подвергаются перекисному окислению, приводящему к потере функциональ­ности или к образованию токсичных альдегидов, таких как ма­лоновый диальдегид и гидроксиноненал (Martin, Grotewiel, 2006).

В стареющих клетках животных (от нематод до человека) на­капливаются неперевариваемые продукты оксидативной деграда­ции клеточных компонентов, так называемый «липофусцин» (Ga- rigan et al., 2002). Липофусцин быстрее накапливается у мутантов с ускоренным старением, например у короткоживущих нематод с дефектом гена aak-2, участвующего в сенсировании энергетиче­ского состояния клетки (Apfeld et al., 2004). Мутация в гене mev-1, кодирующем субъединицу митохондриальной сукцинатдегидро­геназы, также ускоряет накопление гранул липофусцина и старе­ние в целом (Guarente, Kenyon, 2000).

Почему модифицированные компоненты клетки накапливают­ся с возрастом? Причина не только в выработке свободных ради­калов. Для выживания важна элиминация повреждений. Напри­мер, гомеостаз белков поддерживается следующими процессами: 1) репарацией последовательностей аминокислот метионин-суль- фоксидредуктазами; 2) восстановлением конформации белков ша- перонами; 3) удаление поврежденных белков; 4) изоляцией таких белков в твердофазные агрегаты (Soti, Csermely, 2007). Аналогич­но действуют системы метаболизации ксенобиотиков. В то же время рассматриваемые системы имеют ограниченные возмож­ности по детоксификации, которые к тому же снижаются с воз­растом и ингибируются неправильно уложенными или агреги­рованными белками, липофусцином, малоновым диальдегидом (Tavernarakis, Driscoll, 2002).

Что касается деградации белков, то известно, что в клетках при­сутствуют три основные протеолитические системы: протеосомная, лизосомальная и кальпаиновая (кальпаины — это кальцийзависи- мые протеазы, ответственные за обмен цитоскелетных и мембран­ных белков) (Rattan et al., 2004). Среди этих систем следует отме­тить 20S-коровый протеосомный мультикаталитический комплекс, который ответственен за деградацию большинства окисленных, агрегированных или неправильно уложенных белков. Протеосома находится в цитоплазме, ядре или в мембранных структурах и со­ставляет около 1 % всего белка в цитозоле (Rattan et al., 2004).

У стареющих червей дикого типа экспрессия компонентов протеосомы возрастает. По-видимому, это связано с компенсатор- 207 ным ответом на возрастные дегенеративные изменения. У долго­живущих мутантов daf-2 с возрастом наблюдаются снижение экс­прессии компонентов протеосомы, но высокая экспрессия аспар- тиловых протеаз (Golden, Melov, 2004). В целом у daf-2 снижают экспрессию примерно 59 генов, регулирующих белковый метабо­лизм, в том числе протеолиз и пептидолиз (например, гены asp и spp) (Halaschek-Wiener et al., 2005). Тем не менее у мутантов daf-2 активизируется процесс автофагии, деградации и обмена белков внутри лизосомальных автофагосом (Hansen et al., 2005). Когда с пищей поступает мало аминокислот, снижение TOR-сигналинга приводит наравне с долгожительством еще и к сверхактивации автофагии (Walker et al., 2005). Систематический поиск генов Cae- norhabditis elegans с использованием масштабной РНК-интерфе- ренции выявил локусы, подавление экспрессии которых ведет к увеличению продолжительности жизни.

В мышцах грудного отдела тела, т. е. в метаболически актив­ной ткани, у стареющей мухи происходит сверхактивация генов субъединиц протеосомы (Girardot et al., 2006). По другим сведе­ниям, у дрозофилы старение, так же как и оксидативный стресс, сопровождается снижением активности субъединиц протеосомы и других протеаз (41 ген). Снижение экспрессии генов протеаз может быть связано с падением темпов синтеза и обмена белков (Landis et al., 2004). С возрастом у дрозофилы увеличивается эксп­рессия генов ингибиторов сериновых протеаз и цитохрома Р450 (Pletcher et al., 2002). Продолжительность жизни трансгенных мух увеличивает сверхэкспрессия гена карбоксиметилтрансфе- разы (pcmt), участвующей в репарации поврежденных изоаспар- тиловых остатков белков и метионинсульфоксидредуктазы, репа­рирующей окисленные метионины (Helfand, Rogina, 2003b).

У млекопитающих доказано возрастзависимое снижение про- теосомной функции, наиболее выраженное в отношении пептидил- глутамил-пептидгидролазной активности протеосомы. На уровне мРНК снижается экспрессия a2- и а7-субъединиц протеосомы мышей, что предотвращается ограничением калорийности пищи, а 2-мерный электрофорез выявил, кроме того, снижение количест­ва а3- и а5-субъединиц. Возрастзависимое уменьшение актив­ности протеосомы может быть вызвано и посттрансляционными модификациями, такими как окисление и гликозилирование (Rattan et al., 2004). В гомогенатах мозга старых мышей проис- 208

ходит увеличение времени полужизни окисленных нефункцио­нальных белков, накапливаются конъюгаты убиквитина с белком, что может быть обусловлено снижением деградации на протеосо- мах. При пролиферативном старении фибробластов цитозольная протеосомальная функция также испытывает выраженный спад.

2004) . Сверхактивация Smurf2 — гена ЕЗ-убиквитин-протеинли- газы, запускающей убиквитинирование и протеосомозависимую деградацию белка SMAD1, участвующего в TGF-ß-сигналинге, является последствием изнашивания теломер в фибробластах че­ловека. Активация SMURF2 в молодых фибробластах приводит к остановке роста, появлению морфологических и биохимических изменений, свойственных старению, включая изменение экспрес- 209 сии генов. Как оказалось, SMURF2 использует для индукции фе­нотипа старения Rb- и р53-зависимые механизмы (Zhang, Cohen, 2004).

Помимо детоксификации и протеолиза в процессах антиста­рения важную роль играет автофагия — путь внутрилизосомаль- ной деградации, регулируемый большим семейством генов ATG. В клетках млекопитающих различают три формы автофагии: 1) макроавтофагия утилизирует крупные органеллы, заключая их в вакуоли с двухслойной мембраной, называемые автофаго- сомами; автофагосомы получают кислые гидролазы, объединяясь с поздними эндосомами или лизосомами; 2) при микроавтофа- гии макромолекулы и малые органеллы попадают в лизосомы че­рез инвагинацию мембраны; 3) автофагия, опосредованная ша- перонами, избирательно переваривает белки, характеризующиеся определенной аминокислотной последовательностью (лизин— фенилаланин—глутамат—аргинин—глутамин). Несмотря на то что лизосомальная деградация протекает быстро, она не вполне успешна. Деградация осуществляется одновременно с катализи­руемой железом пероксидацией, приводящей к медленному на­коплению в лизосомах полимерной субстанции липофусцина, не разрушаемого гидролитическими ферментами. В результате ста­реющие постмитотические клетки накапливают экстрализосома- льный «мусор» (дефектные митохондрии и непереваренные бел­ковые агрегаты, не попадающие в лизосомы). Накопление ли­пофусцина приводит к еще большему снижению способности к автофагии (Terman et al., 2007). Мутанты по генам автофагии у дрожжей характеризуются снижением хронологической продол­жительности жизни (Kaeberlein et al., 2007). Выключение у не­матод экспрессии гена автофагии bec-1 (гомолог гена beclin 1 млекопитающих) укорачивает продолжительность жизнь мутан- тов-долгожителей daf-2(e1370). Подавление методом РНК-интер- ференции других генов автофагии нематод, например, atg-7 и atg-12, также сокращает жизнь как червей дикого типа, так и му­тантов daf-2 (Hars et al., 2007). Уровень автофагии снижается с воз­растом и у грызунов (Kaeberlein et al., 2007).

В то время как пролиферирующие клетки способны «разбав­лять» неперевариваемые макромолекулы и органеллы новыми, долгоживущие постмитотические клетки делают это с трудом. Таким образом, в результате недостаточного переваривания окис­ленных макромолекул и органелл посредством автофагии и дру­гих переваривающих систем кардиомиоциты, нейроны и рети­нальные пигментные эпителиальные клетки постепенно накапли­вают биологический «мусор», в том числе уже упоминавшийся липофусцин, дефектные митохондрии и другие органеллы, а так- 210 же аберрантные белки, часто формирующие агрегаты (агресомы). Накопление липофусцина препятствует автофагическому мито­хондриальному обмену, стимулируя накопление постаревших ми­тохондрий, которые плохо вырабатывают АТФ, но образуют все большее количество активных форм кислорода. Оксидативный стресс далее стимулирует повреждение митохондрий и лизосом, снижая способность к адаптации, запуская митохондриальные и лизосомальные проапоптозные пути, последнее приводит к ги­бели клетки (Тегшап е! а1., 2007).

Подводя итоги следует сказать, что возрастзависимое сниже­ние эффективности систем детоксификации, протеолиза и авто- фагии приводит к накоплению вредных молекул, отработанных белковых и липидных агрегатов и нефункциональных органелл. Подобный «мусор» в свою очередь нарушает нормальные клеточ­ные процессы и еще больше ингибирует детоксификацию и авто- фагию. Возникает порочный круг. Сверхактивация компонентов этих защитных систем методами молекулярной генетики вызы­вает увеличение продолжительности жизни.