Несоответствия свободнорадикальной теории

Теория интенсивности жизнедеятельности в современ­ной интерпретации предсказывает, что увеличение уровня метабо­лизма приводит к повышенной генерации свободных радикалов и, таким образом, к снижению продолжительности жизни.

Кроме того, существуют аутбредные линии мышей с высокой интенсивностью метаболизма и потребления кислорода, но более долгоживущие по сравнению с теми, чья интенсивность метабо­лизма ниже.

Семейство митохондриальных рассопрягающих белков (UCP) состоит из пяти членов высококонсервативных митохондриаль­ных белков-переносчиков, присутствующих у всех эукариотов.

Существуют и более явные несоответствия свободнорадикаль­ной теории старения. Например, бактерии, сверхэкспрессирую- щие Fe-Sod или Mn-Sod, неожиданно оказались более чувстви­тельными к индуктору свободных радикалов параквату (Giorgio et al., 2007). Сверхэкспрессия Sod1 — гена антиокислительного фермента у дрожжей не влияет на репликативную продолжитель­ность жизни, а в случае Sod2 даже снижает ее. При этом делеция любого из этих генов значительно снижает продолжительность жизни, прежде всего хронологическую. Таким образом, усиление

антиоксидантной способности не является предпосылкой долго­жительства у дрожжей (Kaeberlein et al., 2005а). Так, при этом из­менения экспрессии генов оксидативного стресс-ответа в старею­щих клетках дрожжей не происходит (Koc et al., 2004). Неожидан­но оказывалось, что мухи, содержащие дополнительные копии трансгенов Mn-SOD и митохондриальной каталазы, т.

У дрозофилы снижение калорийности пищи увеличивает про­должительность жизни, но существенных расхождений с контро­лем уровня митохондриальных свободных радикалов не наблю­дали. Сверхэкспрессия гена митохондриальной адениннуклеотид- транслоказы значительно снижает выход свободных радикалов за счет уменьшения мембранного потенциала, но продолжитель­ность жизни таких мух не отличается от контрольной (Miwa et al., 2004). Следовательно, эффект самого универсального (от дрож­жей до млекопитающих) способа замедления старения — умень­шения калорийности пищи — не связан со снижением выработки свободных радикалов, которое в свою очередь зачастую не сопро­вождается увеличением долгожительства.

Гены, участвующие в ответе на оксидативный стресс и обу­словливающие изменение продолжительности жизни в экспери­ментах молекулярных геронтологов, не проявляют сегрегацион­ного варьирования в естественных популяциях: например, гены каталазы (Cat), Rosy (ry), и Sod. Быть может, это связано с давлени­ем отбора, отметающим такие варианты. Таким образом, они не играют важной роли в формировании продолжительности жизни в естественных популяциях, а также в индивидуальных различиях продолжительности жизни (Flatt, 2004).

Как уже упоминалось, у дрозофил при старении и при окисли­тельном стрессе перекрывается экспрессия лишь 38 % генов. В ре­зультате, между старением и окислительным стрессом рано ста­вить знак равенства. Уникальным для старения следует считать воспроизводимое снижение экспрессии генов энергетического ме­таболизма, среди которых гены окислительного фосфорилирова­ния (42 гена), синтеза АТФ (9), цикла трикарбоновых кислот (13). Это может быть связано с наблюдаемой потерей с возрастом нор­мальных и функциональных митохондрий. Старение характери­зуется существенной индукцией генов антимикробных пептидов (в 5—100 раз). Окислительный стресс выявил достоверное, но ме­нее выраженное (в 2—5 раз) их увеличение (Landis et al., 2004).

Исследования показали, что у общественных насекомых повы­шенная экспрессия антиоксидантов также не является необходи­мой для возникновения долгожительства. У муравья Lasius niger короткоживущие самцы (живут несколько дней) имеют значитель­но более высокий уровень экспрессии Sod1, чем матка (живет до 28 лет) и рабочие (живут 1—2 года). Последние практически не различаются между собой по уровню экспрессии этого фермента. Аналогичные результаты получены для медовой пчелы: анализ 8 антиоксидантных генов (в том числе Cu,Zn-Sod, Mn-Sod и гена каталазы) в разных частях тела маток и рабочих пчел в разных воз­растных группах не выявил различий. Более того, у маток, отли­чающихся исключительным долгожительством, нет генов, коди­рующих функциональные внеклеточные пероксидазы (Parker et al., 2004; Corona, Robinson, 2006; Keller, Jemielity, 2006). Однако сле­дует отметить, что у них была выявлена очень высокая активность гена вителлогенина.

Клеточные культуры млекопитающих со сверхэкспрессией Cu,Zn-Sod страдают от повышенного перекисного окисления ли­пидов и гиперчувствительности к окислительному стрессу (Gior­gio et al., 2007). Мыши, гетерозиготные по мутации Sod2, имеют снижение активности фермента в различных тканях на 30—80 % и не отличаются по средней или максимальной продолжительности жизни от дикого типа, хотя частота рака у них выше (Trifunovic et al., 2005). Снижение активности Mn-SOD на 50 % приводит к увеличению повреждения как ядерной, так и митохондриальной ДНК (т. е. к увеличению количества 8-оксо-2-деоксигуанозина) во всех тканях тела мыши и к повышению частоты рака, но не ведет к уменьшению продолжительности жизни; эти особи также не от­личаются от особей дикого типа по частоте возникновения ката­ракт и по характеру иммунного ответа и формирования глиоксида- тивных продуктов — карбоксиметиллизина и пентозидина в кол­лагене кожи (Remmen et al., 2003). Аналогичным образом, двойные мутанты мышей по двум митохондриальным антиоксидантным ферментам Sod2+^/-/Gpx1^/- живут нормальное время, хотя обладают повышенной чувствительностью к окислительному стрессу (Trifunovic et al., 2005). У мышей с мутациями Sod2+'^- и Gpx4+^- также не наблюдается преждевременной индукции р53-зависимой транскрипционной программы старения (Edwards et al., 2007).

Обобщение, предполагаемое теорией интенсивности жизне­деятельности, опровергается еще и тем, что летающие птицы и летучие мыши характеризуются непропорционально долгой жизнью (по сравнению с нелетающими членами классов сходного размера), поскольку они имеют высокую скорость метаболизма и, как следствие, должны были бы иметь большую подверженность окислительным повреждениям.

Однако есть и более парадоксальные исключения. Голые сле­пыши (Heterocephalus glaber, Bathyergidae) — это мелкие подзем­ные грызуны (35 г), живущие в неволе до 30 лет. Данный рекорд принадлежит самцу, прожившему более 28.3 лет при стандартных лабораторных условиях. Этот результат тем более впечатляет, что лабораторные гипероксичные атмосферные условия не являются физиологичными для данного вида, обитающего под землей. Сле­пыши живут на порядок дольше, чем можно предположить при размерах их тела и интенсивности метаболизма, основываясь на аллометрическом уравнении Протеро и Юргенса. Коэффициент продолжительности жизни (соотношение предсказанной по массе тела и реальной продолжительности жизни) данных животных со­поставим с наблюдаемым у человека и превышается таковой толь­ко у определенных видов летучих мышей. Он живет дольше даже таких долгоживущих и более массивных грызунов, как дикобразы, белки и бобры. Впечатляющая продолжительность жизни голых слепышей сопровождается отсутствием связанных с возрастом физиологических модификаций, наблюдаемых у многих других млекопитающих. Кроме того, слепыши сохраняют репродуктив­ную способность до третьего десятилетия жизни. Низкая внешняя интенсивность смертности, связанная с существованием в защи­щенном подземном местообитании, может приводить к эволюции физиологических и биохимических механизмов, стимулирующих самоподдержание соматики и продление плодовитости у данного грызуна (Andziak, Buffenstein, 2006; Andziak et al., 2006). При этом антиоксидантный статус слепыша вовсе не превосходит таковой у мышей, живущих на порядок меньше. Слепыши характеризуют­ся очень низкой активностью клеточной глутатионовой перокси- дазы без компенсаторной сверхактивации других ферментов анти­окислительной защиты. Практически полное отсутствие фермен­тативной защиты от перекиси водорода увеличивает вероятность оксидативного стресса и делает их чувствительными к возраст- зависимым изменениям окислительных факторов, таких как внут­риклеточный уровень железа (Andziak, Buffenstein, 2006). Как ре­зультат, у слепышей в 10 раз выше уровень перекисного окисления липидов in vivo, в 2 раза — повреждений липидов (малондиальде- гид и изопростаны), в 2—8 раз больше повреждений ДНК (8-оксо- гуанина) и 1.5—2 раза — повреждений белка (карбонилы) в моче и различных тканях, чем у мышей того же биологического возрас­та (Andziak et al., 2006).

Рассматривая роль свободных радикалов в старении и особен­но методы борьбы с ними, следует иметь в виду, что свободные ра­дикалы необходимы клетке для нормального ее функционирова­ния. Активные формы кислорода участвуют в redox-зависимой ре­гуляции различных функций клетки, таких как энергетический метаболизм, апоптоз, ответ на стресс или ростовые сигналы. Одна­ко не все они выполняют сигнальную роль. В отличие от ОН^- или 0₂^- , перекись водорода (H₂O₂) способна проникать через мембрану, растворима, менее реактивна и существует дольше. Внутри­клеточный уровень Н₂0₂ в норме регулируется различными фак­торами роста: EGF, PDGF, NGF, инсулином. Н₂0₂ ингибирует ключевые фосфатазы, вовлеченные в снижение трансдукции сиг­нала от активированных рецепторов факторов роста. Н₂0₂ вы­полняет функцию сигнальной молекулы благодаря своей способ­ности вызывать обратимые модификации белков. Она окисляет цистеиниловый тиол с образованием дисульфидных мостиков и сульфениламидных связей, индуцирует глутатионилирование ци­стеиновых остатков или сульфоксидацию метиониновых остатков в составе различных мишеней, среди которых транскрипционный фактор Papi и киназа Styl дрожжей, а также ариламин-Ы-ацетилт- рансфераза 1, индоламин-2,3-диоксигеназа, фосфорилаза А2, ма­лые связанные с убиквитином модификаторы, фосфатазы (PTP1B, PTEN, LMW-PTP, FAK, SHP2, CDC25), цитоплазматические и ми­тохондриальные пероксиредоксины, аннексин А2, HSF-1, акони- таза, a-кетоглутарат дегидрогеназа, субъединицы коплекса I ды­хательной цепи млекопитающих.

В настоящее время функциональная значимость таких моди­фикаций доказана лишь для некоторых из этих белков, например для фосфатаз, и предполагается для транскрипционного фактора NF-kB. Обратимость вызванных изменений обеспечивают фер­менты — глутаредоксины и сульфиредоксины, что может предпо­лагать регуляторную роль подобных модификаций (Giorgio et al., 2007). Более того, перекись водорода влияет на экспрессию по крайней мере 80 различных генов, включая компоненты митоз-ак- тивирующих протеинкиназ и сигнального пути ядерного факто­ра kB. Следовательно, контролируемое образование перекиси во­дорода в клетке играет положительную физиологическую роль. В то же время, металл-катализируемое расщепление H₂O₂ до OH^- приводит к окислительному повреждению липидов, белков и ДНК (Bayne et al., 2005). Замедление развития нематод с низким уров­нем свободных радикалов может служить еще одним подтвержде­нием того, что цитоплазматические активные формы кислорода влияют на развитие не как деструктивные элементы, а как специ­фичные сигнальные молекулы. По-видимому, они являются ниже­лежащими эффекторами малой ГТФазы Ras, модулирующей сиг­налы развития (Felkai et al., 1999; Balaban et al., 2005).

Таким образом, старение, по всей видимости, не связано с гло­бальным снижением антиоксидантной способности, а ключевыми механизмами оксидативного повреждения при старении являются увеличение выработки активных форм кислорода митохондриями, снижение репарации оксидативных повреждений белков и ДНК и уменьшение деградации окисленных белков протеосомой (Martin, Grotewiel, 2006). Хотя очевидно, что оксидативное повреждение играет важную роль при старении, однако не представляется воз­можным, чтобы оно было единственной его причиной, поскольку степень увеличения продолжительности жизни, связанная с ма­нипуляциями над уровнем оксидативного повреждения, намного скромнее результатов действия специфичных мутаций в генах долгожительства (Guarente, Kenyon, 2000).