<<
>>

Гены репликативного и стресс-индуцирванного клеточного старения

Поскольку «клеточное старение» характеризуется пер­манентной остановкой клеточного цикла и соответствующими мор­фологическими и биохимическими изменениями, то можно пред­полагать его запрограммированность по аналогии с такими фено­менами, как дифференцировка или апоптоз (Balaban et al., 2005).

Таким образом, клеточное старение — это генетическая програм­ма необратимой остановки клеточного цикла, блокирующая реак­цию клетки на пролиферативные стимулы и факторы роста при на­личии нерепарируемых повреждений ДНК (Papazoglu, Mills, 2007).

К клеточному старению способно приводить изменение эксп­рессии таких генов, как Ras, Raf, E2F1, MEK, p53, p16, Rb, и гена теломеразы (Cao et al., 2003). В старении участвуют также киназа p38 и транскрипционные факторы NF-kB и C/EBP (Hardy et al., 2005). Все они являются регуляторами клеточного цикла или уча­стниками сигнальных каскадов стресс-ответа.

Как известно, прохождение цикла клеточного деления контро­лируется активностью циклин-зависимых киназ (CDK).

В Gi-фа­зе клеточного цикла CDK4 и CDK6 активируются, связываясь с D-типом циклинов, тогда как индукцию CDK2 запускают цикли- ны E и A. Как комплекс циклин E — CDK2, так и комплекс цик- лин D — CDK4/6 фосфорилируют белок ретинобластомы (Rb), за­дача которого — изолировать и инактивировать отдельные белки

ДНК ч ^коРочение тел01У|еР

Необратимая задержка клеточного

цикла - клеточное старение

121

л Транскрипция генов белков.

необходимых для синтеза Д! 1К

Рис. 1. Механизмы репликативного и стресс-индуцированного клеточного

старения.

Здесь и далее, рис. 2—9, 12 и 16, см. условные обозначения, представленные в рам- ке на этом рисунке.

E2F-семейства транскрипционных факторов. Фосфорилирование Rb высвобождает E2F, что приводит к транскрипции генов, необ­ходимых для вступления в S-фазу клеточного цикла, т. е. в фазу синтеза ДНК (HerЫg, Sedivy, 2006).

Для эффективного выведения клетки из клеточного цикла активность CDK должна ингибироваться, что предотвращает фос­форилирование Rb и запуск E2F-зависимой транскрипции генов пролиферации. Такая необходимость может возникнуть, напри­мер, при получении ДНК клетки серьезных повреждений, как это бывает при старении. Известно два семейства ингибиторов CDK. Семейство CIP/KIP включает белки _р21, р27 и р57. Другое семей­ство, ШК4, состоит из белков p15 , р^^41, p18ІNK4c и р191№;'и. Некоторые из этих ингибиторов сверхэкспрессируются в старею­щих клетках человека. Наиболее изучены пути активации р21 и р16 (рис. 1). Количество р21 в клетке регулируется на уровне транскрипционной активации и посттранскрипционной стабили-

зации мРНК и белка. Уровень мРНК белка р21 увеличивается под действием транскрипционных факторов Sp1, Sp3, E2F, STAT, AP2 и, наконец, p53, играющих ключевую роль в поддержании стаби­льности генома (см. разд. 2.2.3). Транскрипционная активация ге­на р21 в ответ на повреждение ДНК и онкогенные сигналы опо­средована преимущественно р53 (Herbig, Sedivy, 2006). Белок р53 совместно со своим позитивным регулятором ARF, активирует терминальный ответ (остановку клеточного деления), который уда­ляет поврежденные клетки из пролиферативного пула (Matheu et al.,

2007) .

Каким образом р53-зависимая индукция р21 приводит к кле­точному старению? Белок р21 ингибирует ключевые регуляторы клеточного цикла — циклин-зависимые киназы, а также блокиру­ет репликацию ДНК, связываясь с ядерным антигеном пролифери­рующих клеток (PCNA).

Он также способен индуцировать необра­тимую остановку роста по р53-независимому пути (Macip et al., 2002). Кодируемые локусом TNK4A-ARF белки p16INK4A и p14ARF (ARF) также представляют собой ключевые регуляторы клеточного старения. Оба этих белка являются супрессорами опухолей, расположенными в иерархии регуляции над p53 и pRB. Уровень р 16 увеличивается в ответ на способствующие бласттрансформа- ции гипермутагенные сигналы, такие как свехэкспрессия RAS, ки­назы MAP или MYC (Herbig, Sedivy, 2006; Bracken et al., 2007). Бе­лок p16INK4A также выступает в роли ингибитора CDK4 и CDK6 при старении клетки (Rheinwald et al., 2002). Как и уровень р21, концентрация р 16 не увеличивается постепенно при клеточном старении, а способна быстро возрастать в отдельных клетках, ис­пытывающих оксидативный или генотоксический стресс. Связано ли это с критическим укорочением теломер? По-видимому, по­вреждение теломерной ДНК лишь создает пермиссивные условия для увеличения уровня р 16, не являясь необходимым условием (Herbig, Sedivy, 2006). Тем не менее оба пути клеточного старения (р21 и р16) объединяются на pRB, останавливая репликацию ДНК и деление клетки (Patil et al., 2005).

Как уже упоминалось в предыдущем разделе, у мышей нет репликативного (р21-зависимого) старения. Поэтому/>/6является главным геном клеточного старения у мышей. Экспрессия^ 16ШК4А и ARF существенно увеличивается с возрастом практически во всех тканях грызунов, при этом заметного изменения экспрессии других родственных ингибиторов клеточного цикла не происхо­дит. Экспрессия ЫЫа/Arf не только тесно связана с клеточным старением и нарушением пролиферации, но и коррелирует с эксп­рессией другого маркера клеточного старения — старение-ассо- циированной ß-галактозидазы (Krishnamurthy et al., 2004).

Одним из регуляторов гена клеточного старения p16 является группа белков Polycomb и взаимодействующая с ними группа белков Trithorax (рис. 1). Они формируют комплексы, подавляющие и активирующие генную экспрессию путем перестройки хроматина и модификации гистонов в промоторной области генов (Her-big, Sedivy, 2006).

Первый комплекс, Bmil-содержащий Polycomb- репрессирующий комплекс 1 (PRC1), существует во многих вариантах. Он также содержит белки CBX (CBX2, CBX4, CBX6, CBX7 и CBX8), PHC1-3, RNF1-2 и SCML1-2. Второй (Trithorax) комплекс — PRC2 содержит метилтрансферазу гистонов EZH2, которая совместно с белками EED и SUZ12 триметилирует ги-стон H3 по лизину 27 (с образованием гетерохроматиновой метки H3K27me3). Оба комплекса взаимодействуют между собой: способность PRC1 регулировать состояние хроматина зависит от функции PRC2, поскольку PRC1 подавляет экспрессию гена, связываясь только с H3K27me3-меткой (Bracken et al., 2007).

Каким образом эти регуляторы структуры хроматина контро­лируют экспрессию гена клеточного старения р16? Дело в том, что Bmi1 вместе с другими белками группы Polycomb, связываясь с H3K27me3-меткой, блокирует локус Ink4a/Arf. Подавление зависит от функции EZffi-содержащего PRC2-комплекса, генерирующего метку. В то же время, уровень белка EZH2 снижается в подверженных стрессу или старению клетках. Это снижение приводит к потере H3K27me3, вытеснению Bmi1 и активации транскрипции p16, а в результате — к клеточному старению (Bracken et al., 2007).

По-видимому, раскрытие определенных хроматиновых доменов (переход из гетеро- в эухроматин) с последующей активацией кластеров старение-ассоциированных генов может быть одной из основных причин клеточного старения. Несмотря на то что изменение экспрессии при старении существенно отличается в фиб-робластах и клетках эпителия, можно выделить физические кластеры сверхактивации в определенных участках хромосом. Так, выше уже упоминался локус Ink4a/Arf Еще одно подтверждение состоит в том, что ингибиторы гистоновых деацетилаз (конденсирующих хроматин) индуцируют в человеческих фибробластах состояние клеточного старения. Деацетилаза гистонов SIRT1, напротив, приводит к гетерохроматинизации и, таким образом, противостоит PML-p53- индуцированному старению (см. разд. 3.3) (Zhang H. et al., 2003).

Стареющие ткани характеризуются состоянием хронического стресса даже при отсутствии внешних стрессоров.

Это проявляется в увеличении уровня активности генов стресс-ответа, например генов острой фазы ответа, через индукцию контролирующих

их транскрипционных факторов (С/ЕВРа и C/ЕВРР). Кроме того, происходит повышение базального уровня p38 митоген-активи- руемой протеинкиназы (MAPK) и SAPK/JNK стресс-сигналинга. Какова причина их активации в ответ на стресс? Дело в том, что в свободной от стресса клетке восстановленная форма тиоредо- ксина (Trx) взаимодействует с N-концевой частью апоптоз-стиму- лирующей киназы 1 (ASK1), ингибируя активность этой серин - треониновой киназы MKKK-семейства. Окисление Trx, например активными формами кислорода, нарушает комплекс, приводя к активации ASK1. Далее уже следует активация стресс-ответов p38 MAPK и SAPK/jNK (Hsieh, Papaconstantinou, 2006). Белок p38 — стресс-индуцируемая изоформа MAPK. MAPK p38 вносит свой вклад в начало старения, индуцируемого укорочением теломер, оксидативным стрессом, культуральным шоком или активацией RAS/RAF-сигналинга (Naka et al., 2004). В результате активации р38 MAP-киназного пути, в частности р38-активирующих киназ MKK3 и MKK6, уровень экспрессии pi 6 повышается (рис. 1). Ме­ханизм выглядит следующим образом: стресс-индуцированный р38-сигналинг приводит к экспрессии белка ATF3, репрессора транскрипции гена Idl. Поскольку белок Id1 подавляет транскрип­ционные факторы ETS1 и ETS2, ETS-зависимая транскрипция ге­на р16 возрастает (Herbig, Sedivy, 2006). Сигналинг MAP-киназ­ного пути может инициироваться факторами роста или другими митогенами, которые активируют ERK-каскад фосфорилирова­ния, либо цитокинами и стресс-сигналами, активирующими р38- и JNK-каскады. Некоторые белки ERK-пути (RAS, RAF, MEK) спо­собны увеличивать количество белка р16 в клетке. Дело в том, что их нижележащими мишенями являются те же транскрипционные факторы ETS1 и ETS2. Однако делают ли они это при клеточном старении? Известно, что уровень белка ETS1 с возрастом клетки увеличивается, а его негативного регулятора Id1 — уменьшается. Однако активность MEK с возрастом, напротив, снижается.

Та­ким образом, RAS/RAF/MEK-механизм может и не отвечать за уве­личение уровня р16 при клеточном старении (Herbig, Sedivy, 2006).

Первичные культуры кератиноцитов человека перестают ста­реть при подавлении активности гена 14-3-За, участвующего в экстраклеточном сигналинге и стресс-ответе. Его выключение со­провождается существенным снижением количества белка р 16 и реактивацией теломеразной активности. Восстановление функции 14-3-За приводит к повышению уровня р 16 и к репликативному старению. В других тканях данный механизм отмечен не был (Her­big, Sedivy, 2006).

Протеинкиназа ATM (ataxia-telangiectasia-mutated) — ключе­вой белок, отвечающий за распознавание поврежденной ДНК.

В частности, именно он передает сигнал об укороченных теломе­рах на р53 (рис. 1). Играет ли ATM роль в другом, стресс-индуци- рованном, типе старении клетки? При наличии разрыва цепочки ДНК АТМ вызывает активацию белка ATF3, участвующего в MAPK р38-сигналинге, контролирующем p16. Кроме того, ATM может выступать триггером стресс-активируемого MAPK-сигна- линга путем активации ядерной тирозинкиназы c-Abl. Тем не ме­нее индукция стресс-индуцированного старения в клетках с мута­цией ATM, сверхэкспрессирующих TERT (т. е. лишенных друго­го типа старения — репликативного), не отличается от таковой в нормальных фибробластах, что предполагает существование ATM-независимого пути SIPS (Naka et al., 2004).

Таким образом, увеличение уровня белка р 16 в стареющих клетках является результатом комбинации различных сигналь­ных каскадов, активирующихся под действием стресс-ответа (че­рез p38 MAPK и ERK, а также 14-3-3о) или вследствие возраст- зависимого изменения структуры или целостности ДНК (через Bmi1/EZH2 и ATM).

Важная роль в клеточном старении принадлежит также проми- елоцитному белку лейкемии (PML). Белок PML является компо­нентом структур, известных под названием «ядерные тельца» и связанных с процессами старения, апоптоза и дифференцировки клеток. В ответ на старение-индуцирующие стимулы размер и чис­ло PML ядерных телец в клеточных культурах значительно возрас­тает (Keyes et al., 2005). PML имеет отношение к р53-индуциро- ванному старению (Zhang H. et al., 2003). Кроме того, клеточное старение в культуре клеток может вызываться подавлением мето­дом интерференции РНК активности транскрипционного фактора FOXO3a, что проявляется в изменении клеточной морфологии, увеличении времени удвоения популяции, накоплении активных форм кислорода, окрашивании на ß-галактозидазу и активации р53/р21-механизма (Kim et al., 2005).

Возрастзависимое стресс-индуцированное изменение активности транскрипционных факторов и степени гетерохроматиниза-ции участков хромосом приводит к изменению экспрессии генов. Среди тех генов, экспрессия которых меняется как в стареющих, так и в деиммортализованных клетках (модель синхронного старе­ния клеточной культуры), можно выделить DUSP1, RGS3, NR4A3, GAS6, PLOD2, ген неприлизина (MME), IGFBP4, а также FOXM1, ген ядерного нуклеопротеина A1 (HNRPA1), HMG17L1, CDC25B, CENPF, гены регулятора цитокинеза (PRC1) и убиквитин-конъю- гирующего фермента 2C (UBE2C). К генам, изменяющим экспрес­сию только в стареющих клетках, относятся гены металлотио- неинов, коллагена 6A3 (COL6A3), усилителя коллагеновой про- 107

теиназы (COLCE), остеобласт-специфичного фактора 2 (OSF2), и ген MGP. Изучение экспрессии подтвердило такие свойства кле­точного старения, как активация р53-механизма и участие членов семейства Rb и инактивации ERK в репрессии генов синтеза ДНК, в цитокинезе и в других аспектах пролиферации. Выявлено нали­чие отрицательной обратной связи, которая не только стабилизи­рует экспрессию генов при старении, но и компенсирует сверхэкс­прессию других генов (Hardy et al., 2005). Таким образом, измене­ние экспрессии генов в стареющей клетке является компенсаторной реакцией в ответ на хронический стресс.

В то же время стареющие фибробласты демонстрируют де­регуляцию различных клеточных процессов, таких как воспали­тельный ответ, митоз, клеточная адгезия, транспорт, трансдукция сигнала, метаболизм. Технология экспрессионных ДНК-чипов вы­явила 84 гена, которые в молодых и старых фибробластах отли­чаются по экспрессии более чем 2-кратно. Чрезвычайно активны в старых клетках гены IGF-связывающих белков 3 и 5 и Groa, которые регулируют рост клетки. Увеличение активности генов CD36 иБРР4 можно приписать дерегуляции метаболизма жирных кислот и ухудшению метаболизма глюкозы, потере чувствитель­ности к инсулину. Г ены, обеспечивающие клеточный цикл, митоз и цитокинез, такие как G0S2, CENP-F (ген белка центромера-ки- нетохорного комплекса в митозе) и KIF4A (участвует в стабилиза­ции веретена деления), снижают свою экспрессию в постаревших клетках, так же как гены адгезии и внеклеточного матрикса — EPB41L3/Dal-1, OSF2, ISLR, гены нейротримина и дерматопон- тина (Yoon et al., 2004). В другом эксперименте сравнение протео- мов молодых и подвергшихся репликативому старению эмбрио­нальных фибробластов человека выявило 13 белков, изменяющих свою экспрессию. Часть из них является компонентами цитоскеле­та, участвует в метаболизме и выработке энергии, Са2+-сигналин- ге, ядерно-цитоплазматическом транспорте и регуляции актив­ности теломер (Trougakos et al., 2006).

Стареющие клетки характеризуются определенными (пере­численными в разд. 2.1.1) морфологическими изменениями. Ка­кие молекулярные механизмы лежат в основе этих изменений? В процессе старения сверхактивируются такие белки цитоскелета, как »-актин, тубулин и виментин, в то же время снижается эксп­рессия кератина. Кроме того, меняется физиология клетки — ее энергетический статус. При старении активируются цитоплазма­тические гликолитические ферменты a-енолаза и креатинкиназа, отвечающие за распределение энергии в тканях с высоким энер­гопотреблением, снижается экспрессия одной из цепей фермен­та анаэробного гликолиза L-лактатдегидрогеназы. Наблюдаемая

с возрастом сверхактивация аннексина I, способствующего распо­знаванию и перевариванию апоптозной клетки фагоцитами, может служить для удаления постепенно накапливающихся стареющих клеток. Снижение ядерно-цитоплазматического транспорта при старении клетки обусловлено такими изменениями, как подавле­ние экспрессии активирующего белка RAN-специфической ГТФа- зы. Репрессия молекулярного шаперона р23, участвующего в фор­мировании теломеразного комплекса, может служить дополни­тельной противоопухолевой защитой (Trougakos et al., 2006).

Индуцированная активностью р16 остановка клеточного цик­ла (стресс-индуцированное старение) не связана с центрами сосре­доточения укороченных теломер в культуре клеток (Shay, Wright, 2004). Короме того, сверхэкспрессия hTERT не отменяет SIPS (Na- ka et al., 2004; Pascal et al., 2005). Таким образом, укорочение тело­мер не ведет к стресс-индуцированному старению. Тем не менее репликативная и стресс-индуцированная формы старения все же пересекаются (рис. 1) (Pelicci, 2004). Об этом свидетельствует и сходство экспрессируемых генов при обоих типах клеточного ста­рения. Наблюдается сходная экспрессия генов задержки роста (PTEN, IGFBP-3, LRP-1 и CAV1), морфогенеза старения (TGF/31 и LOXL2) и метаболизма железа (TFR и FTL). Одинаково сверх- экспрессируются гены аполипопротеина J (apoJ), фибронектина, остеонектина, трансформирующего фактора роста P1 (TGFfil и кавеолина 1. Среди них Apo J обладает внеклеточной шапероно- подобной активностью. Фибронектин является важным компонен­том внеклеточного матрикса и может быть ответственным за мор­фологические изменения в стареющих фибробластах. Остеонек- тин — кальций-связывающий белок, ингибирующий вступление клетки в S-фазу через избирательное связывание фактора роста PDGF. TGF-P1 контролирует появление маркеров клеточного ста­рения в ответ на стресс. Кавеолин 1 — структурный белок, являю­щийся компонентом кавеолярных мембран и участвующий в кон­центрировании, организации и модулировании сигнальных моле­кул (Pascal et al., 2005).

Таким образом, очевидно, что старение клеток есть результат комплексного взаимодействия между генетическими факторами и возрастзависимым накоплением разнообразных стохастических повреждений (Trougakos et al., 2006). Суммируя вышесказанное, следует сказать, что существует два молекулярных механизма клеточного старения — р21- и р 16-зависимые (рис. 1). В ответ на повреждение ДНК, которое распознается ATM и передается на транскрипционный фактор р53, происходит индукция ингибитора клеточного цикла р21. В активации р 16 важную роль играют сти­муляция MAPK p38-, SAPK/JNK- и ERK-каскадов фосфорилиро- 109 вания активными формами кислорода, а также эпигенетические изменения хроматина (потеря гетерохроматинизации) в результа­те возрастзависимого снижения экспрессии метилтрансферазы ги­стонов Е2И2 и повреждения ДНК (через АТМ). Важно отметить, что активация этих механизмов не является прерогативой клеточ­ного старения. Она обратимо происходит при кратковременных стрессах. Нормальная функция этих путей — приостановить кле­точный цикл, чтобы предоставить клетке время для устранения повреждений перед делением. Старение сопровождается хрони­ческим стрессом (сверхпродукция свободных радикалов, присут­ствие нерепарируемых двухцепочечных разрывов в виде укоро­ченных теломер, эпигенетические изменения хроматина), что в ре­зультате индукции вышеперечисленных механизмов приводит к перманентной остановке делений.

Каким образом происходит выключение клеточного цикла? Репликативная (АТМ/р53/р21-механизм) и стресс-индуцирован- ная (р38/р16-путь) формы клеточного старения, инициируясь раз­ными причинами (укорочение теломер, повреждение ДНК, окис­лительный стресс), соединяются на белке ретинобластомы рББ, подавляющем синтез генов, необходимых для репликации (рис. 1). В следующем разделе рассмотрим экспериментальные данные, свидетельствующие об участии клеточного старения в возрастза- висимых патологических изменениях.

<< | >>
Источник: Москалев А. А.. Старение и гены. — СПб.: Наука,2008. — 358 с.. 2008

Еще по теме Гены репликативного и стресс-индуцирванного клеточного старения:

  1. Москалев А. А.. Старение и гены. — СПб.: Наука,2008. — 358 с., 2008
  2. 1. Главный виновник старения, или как бороться со стрессом
  3. «СТАРЕНИЕ» КОЛЛАГЕНА - УНИВЕРСАЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ СТАРЕНИЯ СТРУКТУР ОРГАНИЗМА, ИЗМЕНЯЮЩИХ СВОЮ ДЛИНУ.
  4. Главное - окружение, а не гены
  5. МЕДИАТОРЫ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА
  6. РЕЦЕПТОРЫ КЛЕТОЧНЫЕ
  7. ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ
  8. АНТИТЕЛА КЛЕТОЧНЫЕ
  9. Получение клеточных суспензий из костного мозга
  10. БОЛЕЗНЬ СЕРПОВИДНО-КЛЕТОЧНАЯ
  11. Получение клеточной суспензии из лимфатических узлов, тимуса и селезенки
  12. Старение организма
  13. Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность
  14. Глава 5. Внешняя среда и болезни старения
  15. КАК ПРЕДОТВРАТИТЬ СТАРЕНИЕ КОЖИ ЛИЦА
  16. ДИСБАЛАНС: КОЖНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ И СТАРЕНИЕВ СВЕТЕ ВЗАИМОСВЯЗЕЙ МЕЖДУ УМОМ И ТЕЛОМ
  17. ФИЗИЧЕСКИЕ И ДЫХАТЕЛЬНЫЕ УПРАЖНЕНИЯ, ЗАДЕРЖИВАЮЩИЕ ПРОЦЕССЫ СТАРЕНИЯ
  18. РАСТЯЖЕНИЕ ПРОТИВОДЕЙСТВУЕТ «СТАРЕНИЮ» КОЛЛАГЕНА ОРГАНОВ И РАЗВИТИЮ В НИХ ВОЗРАСТНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ